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Vers de nouveaux outils de détection des virus de la jaunisse

Dans le cadre du projet Provibe, INRAE de Colmar travaille sur la mise au point des nouveaux outils de détection des virus, transférables à la filière, aux semenciers, et plus globalement à l’ensemble des chercheurs impliqués dans le PNRI.

Les outils actuels ne sont pas optimisés pour l’analyse rapide des virus présents dans les plantes ou les pucerons. Manque de spécificité des sérums, techniques coûteuses, inadaptées à la détection rapide des 4 virus au sein d’un même test, l’optimisation de nouveaux outils est cruciale pour accompagner le développement de solutions de lutte contre les jaunisses virales.

 

Optimisation des tests sérologiques

 

Parmi les 4 virus actuellement recherchés en betterave, il en existe 2 qui appartiennent au même genre (Polerovirus) dans la famille des  Luteoviridae, le BMYV et le BChV. Ces 2 virus très proches génétiquement ne peuvent pas être différenciés par les tests sérologiques disponibles. Martin Drucker, Directeur de Recherche à INRAE de Colmar travaille donc sur la mise au point de nouveaux sérums, capables de détecter spécifiquement l’un ou l’autre de ces 2 virus. Les différentes approches envisagées sont l’emploi des nanobodies issus des dromadaires ou des banques de clones, des anticorps monoclonaux et la technologie de la déplétion négative.

 

La technique RT-LAMP

 

Monique Beuve, Ingénieure d’étude à INRAE de Colmar, travaille sur la mise au point de la technique de RT-LAMP afin de détecter les 4 virus dans les plantes et dans les pucerons. Par rapport à la RT-PCR classique, cette méthode présente l’avantage d’être aussi sensible, plus rapide, moins coûteuse et contourne l’étape de purification d’ARN. La mise en place de cette technique ne nécessite pas d’appareillage sophistiqué à l’exception d’un bain marie thermostaté. Tout l’enjeu réside dans la conception des amorces afin de détecter spécifiquement chaque virus (3 « paires d’amorces » pour la détection d‘un seul virus alors qu’une seule paire d’amorces est requise pour la RT-PCR).

 

Les amorces sont mélangées au milieu réactionnel avec l’échantillon à analyser, puis s’en suit une incubation à une température constante.  Cette durée d’incubation doit être optimisée afin de permettre la réaction colorimétrique. Des tests sont en cours sur pucerons et sur betterave, pour évaluer la spécificité des amorces pour chaque virus ainsi que la sensibilité de la réaction. Les premières expérimentations réalisées sur le virus BChV donnent des résultats très prometteurs. La mise au point est en cours sur le BYV, puis suivront le BMYV et le BtMV.

 

 

La technique IC-RT-PCR multiplexe

 

Aurélie Marmonier, Assistante Ingénieure à INRAE de Colmar, développe de son côté la technique d’Immunocapture-RT-PCR multiplexe. Elle présente l’avantage de s’affranchir des étapes de broyage de l’échantillon dans l’azote liquide et d’extraction de l’ARN, contraignantes et coûteuses dans la RT-PCR classique.

Les premières étapes de cette technique présentent des similitudes avec  la technique sérologique Elisa : un anticorps dirigé contre le virus est déposé au fond des puits d’une plaque avant le dépôt de l’échantillon de plante infectée par le(s) virus. La plaque est ensuite chauffée pour dissocier les capsides virales et libérer les ARNs viraux. Le test moléculaire par RT-PCR multiplexe peut ensuite être réalisé. Le terme multiplexe signifie que les 4 virus peuvent être analysés en une seule étape.

 

 

Les premiers résultats montrent qu’en condition de mono-infection, tous les virus peuvent être détectés. Les tests sont en cours sur les plantes multi-infectées.

 

Le développement en parallèle de ces différentes méthodes facilitera l'accès à une ou plusieurs techniques, permettant la détection simultanée des 4 virus majeurs de la betterave à des fins de diagnostic, d’épidémiosurveillance, de criblage de ressources génétiques et de recherche.

 

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